Die Kirche ist die Pfarrkirche der Mühlhäuser Altstadt. König Heinrich (VII.) schenkte sie im Jahr 1227 dem Deutschen Orden. Die an Stelle des älteren Vorgängers zwischen 1270 und 1300 erbaute Hallenkirche gehört zu den frühesten gotischen Kirchen Mitteldeutschlands. Die kurze Bauzeit und die qualitätvolle Ausführung ist dem Deutschordensbischof Kristan von Samland zu verdanken, der Kenntnisse der französischen Kathedralbaukunst über das Vorbild der Marburger Elisabethkirche vermittelte und aus seinem Vermögen den Bau förderte.

Die an Notre Dame in Paris erinnernde Fensterrosette des Nordquerhausportals erhielt im Jahr 2008 eine farbige Verglasung. Die Rosette und die Figuren der Jungfrau Maria und des heiligen Bischofs Blasius machen das der Stadt zugewandte Wimpergportal zum repräsentativen Kirchenzugang. Zur wertvollen Ausstattung der Kirche gehören die Glasmalereien in den Fenstern des Hauptchores aus dem späten 13. Jahrhundert sowie der spätgotische Schnitzaltar mit einer Marienkrönung, der Schutzheiligen des Deutschen Ordens. An der Südseite des Chores befinden sich die Grabplatten des 1295 verstorbenen Bischofs Kristan und des 1566 verstorbenen Superintendenten Hieronymus Tilesius, des Reformators Mühlhausens. Nach der Reformation wurde statt des „Sanctus“ das „Divus“ als Attribut des Kirchenpatrons verwendet, um den Bruch mit der katholischen Heiligenverehrung zu dokumentieren.

Ein schmiedeeisernes Ziergitter aus dem Jahr 1640 trennt den Chor vom Querhaus. Der nördliche Nebenchor wird von einem Triumphkreuz dominiert, während sich im südlichen die Sakristei und darüber der Raum der einstigen Bibliothek befinden. Die 1564/65 geschaffene oder erneuerte Kanzel sowie der Taufstein sind von hoher Qualität. Die aus Berichten über die Bilderstürme der frühen Reformation zwischen 1523 und 1525 bekannte reiche vorreformatorische Kirchenausstattung ist indes weitgehend verloren.

Die wuchtigen von steinernen Helmen bekrönten Westtürme wurden bereits um 1270 vollendet. Sie sind von der Basilika des unmittelbaren Vorgängerbaus der heutigen Kirche geblieben. In ihrer Höhe befindet sich ein klangschönes Geläut von drei Glocken aus den Jahren 1281, 1345 und 1448.

An der Blasii-Kirche wirkende Kirchenlieddichter und Organisten haben Mühlhausen bis heute zu einer bedeutenden Pflegestätte der evangelischen Kirchenmusik gemacht. Höhepunkt war das Wirken Johann Sebastian Bachs 1707/1708. Nach seiner Orgeldisposition wurde die heutige Schuke-Orgel im Jahr 1959 geschaffen.