Das Haupthaus der Mühlhäuser Museen wurde 1868 bis 1870 ursprünglich als Gymnasium im Stil der Neorenaissance errichtet. Seit der Gründung eines Heimatmuseums 1928 wird das Gebäude am Lindenbühl vor allem museal genutzt. Nach einer umfangreichen Modernisierung im Jahr 2013 eröffnete das Haus als Kulturhistorisches Museum neu. Neben zahlreichen auch überregional bedeutenden Sonderausstellungen prägen vor allem die drei ständigen Expositionen das Profil des Museums. Im Erdgeschoss wird die Stadtgeschichte Mühlhausens in einem eigenen Ausstellungsbereich anhand ausgewählter Sammlungsstücke eindrucksvoll präsentiert. Im Fokus stehen dabei u.a. die Rolle Mühlhausens als Freie Reichsstadt und als bedeutender Sitz des Deutschen Ordens, dem der überwiegende Teil der der hiesigen Gotteshäuser im Mittealter unterstellt war.

Im Bereich des Foyers und des repräsentativen Treppenaufganges werden in einer weiteren Dauerausstellung zahlreiche archäologische Fundstücke aus dem Unstrut-Hainich-Kreis gezeigt. Diese Exponate umfassen einen Zeitraum von etwa 6000 Jahren und deuten auf zahlreiche auswärtige Einflüsse hin, welche die Kultur in der Region prägten. Der im Obergeschoss befindliche dritte Ausstellungsbereich thematisiert anhand von etwa 120 Gemälden und Grafiken anschaulich die Kunstlandschaft Thüringens im 20. Jahrhundert. Die einzigartige Schau widmet sich vor allem der Kunst der Moderne inklusive ihrer Vorbilder und Nachwirkungen.